Métodos de Coloração - Método Simples e Método de Gram

Autor:
Instituição: Faculdade JK
Tema: Microbiologia

Coloração Simples e Coloração de Gram


Introdução

Grande parte dos microrganismos presente em nosso cotidiano, e os estudados em laboratórios são microrganismos e quase sempre invisíveis. Por isso há necessidade do uso do microscópio eletrônico e principalmente dos métodos de coloração específicos.

Coloração significa corar os microrganismos com um corante que enfatiza certas estruturas. Essas técnicas de coloração servem para mostrar as varias estruturas dos microrganismos, identificar suas estruturas internas e externas (como flagelos, membranas, cápsulas, entre outros) e ajudar a identificar e separar microrganismos similares. As colorações podem ser feitas com um ou mais corantes. Para colorar um microrganismo é necessário que esteja fixado à lâmina para visualização no microscópio.

Entre os vários métodos de coloração pode-se destacar dois: coloração simples e coloração de Gram.

O método de COLORAÇÃO SIMPLES consiste em uma solução aquosa ou alcoólica de um único corante básico. O objetivo básico desse método é mostrar toda a estrutura do microrganismo incluindo a forma e as estruturas básicas.

A coloração simples é aplicada no esfregaço (fixado por um certo tempo) e então lavada. A lâmina é examinada quando seca. Pode-se adicionar uma substancia química para intensificar a coloração, essa substância é denominada MORDETE, esse mordete aumenta a coloração da amostra microbiológica, reveste estruturas tornando-se mais espessas e mais fácil a sua visualização.

Outro método é a COLORAÇÃO DE GRAM. Esse método foi desenvolvido por Hans Christian Gram. A coloração por ele desenvolvida foi baseada na parede celular para identificação das espécies em dois grupos: Gram positiva e Gram negativa.

Existem outros métodos de coloração além desses citados, como: coloração de resistência ao álcool-acido, coloração para endósporos (esporos), coloração dos flagelos entre outros.


Objetivos

  • Evidenciar microrganismos, verificando diferenças morfológicas e de comportamento tintorial, utilizando colorações.
  • Treinar a técnica de colorações.


Materiais

  • Bateria de corantes (cristal violeta e fucsina) e reagentes (álcool e lugol) para a técnica de Gram;
  • Lâminas;
  • Óleo de imersão, papel absorvente;
  • Culturas de microrganismos: klebsiella e Bacillus thuringiensis;
  • Iogurte natural;
  • Corante azul de metileno;
  • Alça de níquel e bico de Bunsen;
  • Microscópio óptico.


Procedimentos:

Coloração simples e Coloração de Gram

1. Coloração simples

  • Espalhamos o material no centro da lâmina (esfregaço). Deixamos secar a temperatura ambiente.
  • Após a secagem, passamos a lâmina sobre a chama do bico de Bunsen (fixação).
  • Cobrimos o esfregaço com uma gota de azul de metileno durante 1 minuto.
  • Lavamos com água e secamos com papel absorvente. Observamos ao microscópio. Objetiva 100X com óleo de imersão.

2. Coloração de Gram

  • Preparamos um esfregaço de cada um dos materiais microbiológicos;
  • Deixamos secar a temperatura ambiente. Fixamos a lâmina sobre a chama;
  • Cobrimos o esfregaço com solução corante de cristal violeta, durante 1 minuto;
  • Retiramos o cristal violeta através de rápida lavagem com água;
  • Cobrimos o esfregaço com solução de lugol (iodo-iodeto) durante 30 segundos;
  • Lavamos rapidamente com etanol (10 a 15 s) e, em seguida, com água;
  • Cobrimos o esfregaço com solução de corante de fucsina durante 1 minuto;
  • Lavamos com água e secamos suavemente com papel absorvente.
  • Observamos ao microscópio. Objetiva 100X com óleo de imersão.


Resultado e Discussão

Coloração simples

A partir do experimento realizado no laboratório, observou-se que bactérias estavam coradas de azul bem intenso, já que o azul metileno penetrou para o citoplasma de todas as bactérias. Quando a lâmina foi lavada o corante não saiu por que as membranas celulares não permitiram a saída dele do citoplasma das bactérias. O fundo da lâmina estava corado de azul bem claro.

Foi visualizado, após a coloração ao microscópio óptico, a presença de bactérias na forma de cocos e bacilos, sendo que os arranjos eram na forma de cocos isolados, diplococos, estreptococos e bacilos isolados, mas estes eram encontrados em menor quantidade.

No iogurte foram encontrados: Streptococus thermophilus e Lactobacillus sp. Essas bactérias foram encontradas no iogurte por que para a obtenção do aspecto pastoso que ele tem é necessário à fermentação feita a partir dessas.

A fermentação do leite para a produção do iogurte foi feita a partir de enzimas que as bactérias produziram.

Coloração de Gram

Foram usadas 2 lâminas e o procedimento foi o mesmo para ambas as lâminas.

Na primeira etapa após o esfregaço ter sido fixado pelo calor e corado com o cristal violeta, ambas as lâminas coraram-se em roxo, já que o corante penetrou para o citoplasma das bactérias.

A função do iodo nesta coloração é atuar como mordente, ou seja, intensifica a coloração nas duas lâminas.

A função do álcool nas bactérias Gram positivas (lâmina 2) é de ressecar a parede de peptideoglicano. Com isso há formação de uma parede mais firme e contraída de peptideoglicano, impedindo ainda mais a saída do cristal violeta. Nas bactérias Gram negativas (lâmina 1), o álcool tem pouco efeito na parede de peptideoglicano já que esta é bem fina. O álcool também atua danificando a membrana externa e a membrana citoplasmática, fazendo com que o cristal violeta extravase, ou seja, saia do citoplasma.

Na ultima etapa as lâminas foram contracoradas com fucsina, que penetrou no citoplasma somente das Gram negativas, deixando-as vermelhas, já que o citoplasma das Gram positivas estava completamente preenchido pelo cristal Violeta.

Na lâmina oi observou-se que a bactéria era Gram negativa e corou-se em vermelho.

Na Lâmina 02 observou-se que a bactéria era Gram positiva e corou-se de roxo intenso.


Conclusão

No primeiro experimento realizado foram encontrados cocos isolados, diplococos, estreptococos e bacilos isolados.

As bactérias são importante na produção de iogurte, pois elas fazem ele adquirir sua forma pastosa.

Sugiro coloração de bactérias de outras substancias como, por exemplo, da microbiota microbiológica natural como a oral, pois esta pratica foi muito interessante.

No segundo experimento realizado, foram observadas dois tipos de bactérias: Gram positivas e Gram negativas.

A coloração de Gram é particularmente muito importante valiosa em diagnósticos laboratoriais de hospitais, pois tal informação é útil para selecionar um antibiótico (ou outro tratamento) para o paciente.


Bibliografia

PELCZAR, M.J.; E.C.S. e KRIEG, N.R. Microbiologia: conceitos e aplicações.V1. Ed. São Paulo: Makron Books. 1996.

TORTORA, G.J.; FUNKE,B.R. e CASE, C.L. Microbiologia. 6 ed. Porto Alegre: Artmed. 2000.

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