Amigo Nerd.net

Cromatografias e Eletroforese

Autor:
Instituição: UNOESC
Tema: Cromatografias e Eletroforese

Cromatografia e Eletroforese


1. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO MOLECULAR

A cromatografia por exclusão molecular, também chamada filtração em gel, permite a separação de moléculas com base nas diferenças de peso molecular. É um método útil tanto para o fracionamento de moléculas quanto para a determinação de peso molecular. Na cromatografia de exclusão molecular, a mistura de proteínas, dissolvidas em tampão adequado, flui através de uma coluna cheia de esferas microscópicas (contém aberturas e microcanais de tamanhos determinados que permitem a passagem ou retém moléculas de diferentes tamanhos) de um material polimérico altamente hidratado e inerte, previamente lavado e equilibrado com um tampão. As esferas estão disponíveis comercialmente e as mais conhecidas são o Sephadex e a Sepharose, derivados de polissacarídeos, e o Bio-Gel, derivado da poliacrilamida. Quanto mais fino o tamanho de partícula de gel, maior a resolução e menos a vazão da coluna.

Todos eles podem ser preparados com diferentes graus de porosidade interna. Nas colunas, as proteínas de diferentes tamanhos moleculares penetram nos poros internos das esferas em graus variados, percorrendo desta forma a coluna com velocidades específicas. Moléculas protéicas muito grandes não podem penetrar nos poros das esferas e, assim, permanecem no volume excluído da coluna, definido como o volume da fase aquosa que está na parte externa das microesferas. As moléculas pequenas, por penetrarem livremente nos poros das microesferas, têm seu percurso retardado. Como as moléculas menores têm que passar por um volume efetivamente maior, as moléculas maiores são eluídas primeiro.

O principal uso da cromatografia de exclusão molecular é o fracionamento protéico. Se a proteína de interesse é relativamente grande, a filtração em gel pode ser utilizada como uma das etapas iniciais do processo de purificação. A proteína elui nas primeiras frações e todas as proteínas menores permanecem na coluna, permitindo uma purificação considerável. Se o peso molecular aproximado da proteína não é conhecido, a matriz escolhida deve ter uma ampla faixa de fracionamento. Nos processos de purificação protéica, a filtração em gel é muito utilizada em associação com a cromatografia de troca iônica, visto que os dois métodos são complementares.

A filtração em gel é utilizada também para a determinação do peso molecular de uma proteína. A coluna é montada em um tampão adequado, e o volume morto (Vo) é determinado pela passagem de uma solução de azul de dextrano (molécula grande). Os volumes de eluição (Ve) de várias proteínas de pesos moleculares conhecidos são determinados e as razões Ve/Vo calculadas. A representação gráfica do logaritmo do peso molecular das proteínas versus Ve/Vo resulta numa reta que, por interpolação, pode ser utilizada para a determinação do peso molecular de uma proteína. Para uma molécula grande que não penetra no gel, o volume de retenção (Vr) é igual à Vo e Kméd = 0. Para uma molécula pequena que penetra livremente no gel, Vr ˜Vt (volume total da coluna) e Kméd ˜ 1. As moléculas de tamanho intermediário penetram em alguns poros do gel, mas não em outros, de forma que Kméd está entre 0 e 1. A penetração no gel é o único mecanismo pelo qual as moléculas são retidas neste tipo de cromatografia. De fato, sempre há alguma adsorção, de forma que Kméd pode ser maior que 1.

Outros usos de filtração em gel são: a remoção de impurezas de baixo peso molecular (sais [processo denominado dessalinização], pequenos fragmentos protéicos gerados por atividade proteolítica...) de soluções de macromoléculas; a separação das subunidades protéicas no caso de proteínas oligoméricas; a troca do tampão; concentração de solutos; separação de moléculas de mesma carga elétrica, que diferem somente quanto ao peso molecular etc.


2. CROMATOGRAFIA POR TROCA IÔNICA

Na cromatografia por troca iônica, a retenção está baseada na atração entre os íons do soluto e os sítios carregados ligados à fase estacionária.

A separação das proteínas tendo como base sua carga elétrica depende, em última análise, de suas propriedades ácido-básicas, que são grandemente determinadas pelo número e tipo de grupamentos R ionizáveis de suas cadeias polipeptídicas (arginina, histidina, lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico). A um dado pH, uma proteína irá possuir uma carga líquida. Num valor baixo de pH, a carga líquida será mais positiva, e num valor alto de pH, a carga líquida será mais negativa. O pH no qual as cargas positivas igualam as cargas negativas, ou seja, o pH no qual a carga efetiva da proteína é zero, define o ponto isoelétrico da proteína (pI). Para a cromatografia de troca iônica, uma boa regra a ser seguida quando o pI da proteína é conhecido, é selecionar o pH de trabalho distante em uma unidade do seu pI. Neste pH, a proteína terá cara líquida suficiente para se ligar à coluna trocadora e continuará estável, visto que condições mais drásticas, tais como força iônica alta ou significativas variações no pH, podem causar desnaturação.

No processo de troca iônica, os íons eletrostaticamente ligados a uma matriz insolúvel e quimicamente inerte são reversivelmente trocados pelos íons em solução. Uma matriz insolúvel que tenha ligado grupos carregados positivamente (atraem os ânions do soluto) será uma matriz trocadora de ânions, enquanto uma que tiver grupos carregados negativamente (atraem os cátions do soluto) será uma matriz trocadora de cátions. Resinas são partículas amorfas (não-cristalinas) de matéria orgânica. As resinas trocadoras mais comumente utilizadas são Dowex 1 (resina de poliestireno, fortemente básica, trocadora aniônica, contém grupo CH2NR3+), Dowex 50 (resina de poliestireno, fortemente ácida, trocadora catiônica, contém grupo SO3-), DEAE-celulose (básica) e CM - celulose (acídica). As resinas de poliestireno são formadas pela copolimerização do estireno e do divinilbenzeno. O teor de divinilbenzeno está relacionado com a extensão da ligação cruzada (entrecruzamento) do polímero de hidrocarboneto insolúvel. A resina torna-se mais rígida e menos porosa com o aumento do entrecruzamento. Resinas ligeiramente entrecruzadas permitem um rápido equilíbrio do soluto entre o interior e o exterior da partícula. Resinas com pouco entrecruzamento incham na água. Essa hidratação diminui a densidade, os sítios dos trocadores de íons e a seletividade da resina para diferentes íons. Resinas mais intensamente entrecruzadas exibem menos inchamento, maior capacidade trocadora e seletividade, mas possuem maiores tempos de equilíbrio. A densidade de carga dos trocadores de íons poliestireno é tão grande que macromoléculas altamente carregadas, como as proteínas, podem ser ligadas irreversivelmente. Os trocadores de íons de celulose e dextran, que são polímero de glicose, possuem tamanhos de poro maiores e menores densidades de carga. Eles são apropriados como trocadores de íons de macromoléculas, como as proteínas. O dextran, entrecruzado com glicerina, é vendido com o nome de Sephadex.

As resinas de troca iônica são usadas para aplicações envolvendo pequenas moléculas que podem penetrar nos poros pequenos da resina. Os géis trocadores de íons são usados para moléculas maiores (proteínas e ácidos nucléicos) que não podem penetrar nos poros da resina. As separações envolvendo condições químicas severas (alta temperatura, altos níveis de radiação, solução altamente básica ou agentes altamente oxidantes) empregam trocadores iônicos inorgânicos, como os óxidos hidratados de Zr, Ti, Sn, e W.

Suponhamos que uma proteína tenha carga líquida positiva a pH 7. Ela se ligará a uma coluna contendo grupos negativos. Essa proteína poderá ser eluída (liberada) pelo aumento de concentração de cloreto de sódio ou outro sal no tampão de eluição, visto que os íons sódio competirão com os grupamentos com carga positiva da proteína, pela ligação à coluna. Proteínas com baixa densidade de grupamentos carregados tenderão a emergir primeiro, seguidas das que tenham maior densidade de cargas.

Dois tipos de eluição são possíveis com uma coluna de troca iônica: eluição por etapas e eluição por gradiente. Na eluição por etapas, volumes determinados de soluções salinas de forças iônicas crescentes são adicionados. Um gradiente de eluição remove proteínas por um gradual aumento da força iônica. Apesar da eluição por etapas ser um procedimento mais simples e rápido, o gradiente de eluição é mais eficiente, visto que a eluição por etapas pode resultar na eluição simultânea de várias proteínas devido ao grande aumento que ocorre na força iônica quando se passa de uma etapa para outra.

Outros fatores, além da carga global, podem influenciar o comportamento das proteínas em colunas de troca iônica. Os dois mais importantes são as interações entre os resíduos hidrofóbicos das proteínas com as resinas e a formação de pontes de hidrogênio entre as proteínas e o trocador iônico.

A cromatografia de troca iônica é o método cromatográfico mais utilizado nos processos de purificação de proteínas. Sua popularidade deve-se à sua alta resolução, facilidade de uso, reprodutibilidade e baixo custo. O princípio da troca iônica permite que a proteína se ligue mesmo quando um grande volume de tampão é aplicado, tornando o processo especialmente útil nas etapas iniciais de purificação. Para separações nas quais a velocidade é importante (remoção de proteases ou purificação de proteínas com limitado tempo de atividade), a cromatografia de troca iônica pode ser realizada em suportes que permitam fluxo rápido.

Um tipo particular de cromatografia de troca iônica é a focalização isoelétrica, ou cromatofocalização. Na focalização isoelétrica, as proteínas são separadas como resultado da formação isocrática de um gradiente interno de pH nas colunas trocadoras de íons. Se um tampão de determinado pH flui através de uma coluna trocadora de íons equilibrada com um segundo tampão com outro pH, um gradiente é formado à medida que os dois tampões se misturam, e as proteínas ligadas à resina serão eluídas dependendo de seus pI’s. Mesmo que a maioria das proteínas tenha pI na faixa de pH entre 5 e 8, existe uma considerável heterogeneidade dentro dessa região a qual permite uma eficiente separação.

A cromatografia de troca iônica pode ser usada para purificar a água para uso em laboratórios e indústrias (remover íons da água); conversão de um sal em outro; pré-concentração de componentes-traço de uma solução para obter uma quantidade suficiente para a análise; preparação de reagentes; separação de metais; separação e purificação de enzimas, isoenzimas, proteínas, hemoglobina, imunoglobulinas, ácidos nucléicos e aminoácidos.

Vários inconvenientes das extrações líquido-líquido e ácido-base podem ser minimizados usando-se a cromatografia de troca iônica, como por exemplo: formação de emulsões de difícil separação, que comprometem a eficiência do processo de partição; limitação no uso do solvente de extração, já que os dois líquidos devem ser imiscíveis; extração de compostos não ácidos solúveis em água; custo elevado e periculosidade potencial para operador em função de manipulação de volumes elevados de solventes, geralmente perigosos; baixa reprodutibilidade e dificuldades de automatização.


3. CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE

A cromatografia de afinidade é usada para isolar um único composto de uma mistura complexa, desenvolvida durante os anos 60-70, refere-se originalmente ao uso de ligantes naturais imobilizados, que interagem especificamente com uma proteína. O ligante é imobilizado em uma partícula que pode ser empacotada em uma coluna. A amostra contendo a proteína é passada pela coluna e a proteína específica interage com o ligante ficando retida, enquanto as outras proteínas permanecem na fase móvel. Após tudo ter sido lavado, o soluto aderido é eluído mudando-se as condições, como o pH ou a força iônica para enfraquecer sua ligação. A cromatografia por afinidade é aplicável especialmente à bioquímica e está baseada nas interações específicas entre as enzimas e os substratos, anticorpos e antígenos ou receptores e hormônios. Algumas das moléculas mais usadas são: Enzimas (utiliza a especificidade de uma enzima pelo seu substrato, coenzima ou inibidor), anticorpos (geralmente o antígeno é ligado ao suporte e usado para purificar anticorpos) e receptores (podem ser purificados utilizando seus hormônios específicos).

Técnicas de afinidade fazem uso, em geral, de uma interação bioespecífica que resulta em uma mudança nas propriedades da proteína, de tal forma que ela possa ser separada das outras. Não somente pode ser aplicada em colunas cromatográficas, mas também em precipitação, eletroforese e outros métodos de separação. A maioria dos procedimentos é, entretanto, cromatográficos. A cromatografia de afinidade apresenta alta resolução, mas devido ao seu alto custo, é geralmente usada nas fases finais dos processos de purificação protéica, após o material ter sido parcialmente fracionado pelos métodos cromatográficos anteriormente descritos.


4. ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA

O termo eletroforese é utilizado para descrever a migração de partículas carregadas em um determinado meio sob a influência de um campo elétrico. Procedimentos eletroforéticos não são utilizados para fracionamento de moléculas em larga escala, visto que métodos alternativos mais adequados como, por exemplo, os métodos cromatográficos, estão disponíveis. As eletroforeses são, entretanto, especialmente úteis como métodos analíticos, visto que elas permitem a separação e a visualização das proteínas, possibilitando uma análise de heterogeneidade protéica existente em um material, ou a análise do grau de pureza de uma preparação. As eletroforeses permitem também a determinação de uma série de propriedades das proteínas, tais como, seus pontos isoelétricos e pesos moleculares. Para isso, as amostras devem ser colocadas num suporte de tal modo que se defina um campo para a aplicação de corrente elétrica e que permita que as moléculas se movam.

O uso de eletroforese para a separação de proteínas iniciou-se no final da década de 30. As primeiras eletroforeses foram as eletroforeses livres, onde a solução tamponada da mistura protéica era colocada em um célula em forma de U e um campo elétrico estabelecido entre os eletrodos. Essa eletroforese foi rapidamente substituída pela eletroforese de zona, onde a solução protéica é imobilizada em uma matriz sólida ou suporte, um material poroso e hidratado que apresenta rigidez mecânica, eliminando assim a convecção e os distúrbios por vibração. Os primeiros suportes utilizados foram papéis de filtro e acetato de celulose (celofane). A introdução da técnica da eletroforese de zona possibilitou a obtenção de resoluções significativamente maiores do que as obtidas na eletroforese livre. Contudo, foi a introdução de suportes que retardam ou excluem moléculas em função de seus pesos moleculares, tais como os materiais usados na cromatografia de exclusão molecular, que possibilitou a obtenção de uma resolução eletroforética compatível com as necessidades analíticas da bioquímica moderna. O suporte mais empregado com essa finalidade é a poliacrilamida.

O gel de poliacrilamida foi introduzido como suporte nas eletroforeses no final da década de 50 e, desde então, vem sendo amplamente utilizado para a separação de macromoléculas. Quimicamente, o gel é o produto da polimerização da acrilamida e da N,N metileno-bis acrilamida. A formação do gel ocorre por um mecanismo de polimerização vinílica, catalisada pela riboflavina (catalisador fotoquímico) ou pelo persulfato de amônio (catalisador químico). Os dois catalisadores participam da geração de radicais livres, que são estabilizados por uma amina terciária, o TEMED. Os radicais livres formados reagem com a acrilamida, ativando-a. A acrilamida ativada reage com outras moléculas de acrilamida formando ligações cruzadas intercadeias, produzindo uma longa cadeia linear do polímero. Para a formação do gel de poliacrilamida, é necessária a participação da bis-acrilamida, que atua formando ligações cruzadas entre as cadeias lineares, originando uma rede que resulta na formação do gel. O comprimento médio das cadeias lineares é determinado pela concentração de acrilamida e a concentração de bis-acrilamida determina a quantidade de ligações cruzadas. A relação acrilamida/bis-acrilamida determina as propriedades físico-químicas do gel tais como, densidade, elasticidade e tamanho dos poros.

As diferentes técnicas de eletroforese em gel de poliacrilamida baseiam-se na heterogeneidade das seguintes propriedades físico-químicas das proteínas: peso molecular, carga elétrica líquida e ponto isoelétrico.

4.1 Eletroforese com SDS

A eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) é um procedimento eletroforético que separa as proteínas com base nos seus pesos moleculares. O SDS ([CH3-(CH2)10-CH2-O-SO3-]Na+) liga-se às porções hidrofóbicas das proteínas (1,4g de SDS para cada g de proteína), rompendo suas dobras e permitindo que elas existam em conformação estendida estável. Como resultado, o tamanho do complexo proteína-SDS é proporcional ao seu peso molecular. O SDS ligado adiciona um grande número de cargas negativas às moléculas das proteínas, tornando insignificantes suas cargas intrínsecas. Dessa forma, as velocidades de migração dependem exclusivamente dos pesos dos complexos proteínas-SDS, com as proteínas menores migrando mais rapidamente.

A eletroforese com SDS pode ser desnaturante ou não-desnaturante. Se as amostras protéicas forem fervidas e reduzidas (pela adição de b-mercaptoetanol ou ditiotreitol), as proteínas serão desnaturadas e suas possíveis subunidades serão separadas. A eletroforese desnaturante permite a determinação do peso molecular das proteínas. Para essa finalidade, padrões protéicos de pesos moleculares conhecidos são aplicados no mesmo gel da proteína de interesse. Determinando a mobilidade relativa de cada uma das proteínas de pesos moleculares conhecidos, podemos montar uma curva de calibração, representando os valores das mobilidades relativas dos padrões protéicos contra os logaritmos dos seus pesos moleculares.

Na eletroforese com SDS não desnaturante, as amostras não são fervidas e não são utilizados agentes redutores. Como uma grande variedade de proteínas resiste ao tratamento com SDS, após a corrida eletroforética é possível retirar o SDS do gel (banho em isopropanol por 30-60 minutos) e recuperar as proteínas nativas. Caso a proteína seja uma enzima, é possível localizar sua posição no gel.

4.2 Eletroosmose

A parede interna de um capilar de sílica fundida é revestida com grupos silanol (Si-OH) com uma carga negativa acima de pH ˜ 2. Uma camada imóvel de cátions, fortemente adsorvidos, adjacentes à superfície negativa neutraliza parcialmente a carga negativa. A carga negativa residual é neutralizada pelo excesso de cátions móveis solvatados na parte difusa da dupla camada na solução próxima à parede. A espessura da parte difusa da dupla camada se situa na faixa próxima a ~ 10 nm, quando a força iônica é de 1mM, e ~ 0,3 nm quando a força iônica é de 1M.

Em um campo elétrico, os cátions são atraídos para o catodo e os ânions são atraídos para o anodo. O excesso de cátions na parte difusa da dupla camada confere uma energia líquida em direção ao catodo. Esta ação de bombeamento, chamada de eletroosmose (também chamada de eletroendosmose), é conduzida pelos cátions solvatados dentro de ~ 10 nm nas paredes e cria um fluxo osmótico elétrico uniforme na solução inteira em direção ao catodo. Isto está em contraste com o fluxo hidrodinâmico usual, que é conduzido por uma diferença de pressão entre as pontas do capilar. No fluxo hidrodinâmico, o perfil de velocidade por uma seção transversal do fluido é parabólico: é mais rápido no centro e de lento a 0 nas paredes.

A constante de proporcionalidade entre a velocidade da osmose elétrica (uoe) e o campo aplicado é chamada de mobilidade da osmose elétrica (moe).

A mobilidade da eletroosmótica é proporcional à densidade de carga da superfície na sílica e inversamente proporcional à raiz quadrada da força iônica. A osmose elétrica diminui em pH baixo (Si-O- à Si-OH diminui a densidade de carga da superfície) e em força iônica alta. Em pH 9, em tampão de borato 20mM, o fluxo osmótico elétrico é normalmente em torno de 2mm/s. Em pH 3, o fluxo é reduzido em uma ordem de grandeza.

Os fluxos osmóticos elétricos uniformes contribuem para a alta resolução da eletroforese capilar. Qualquer efeito que diminua a uniformidade cria um alargamento da banda e diminui a resolução. A corrente elétrica no capilar (fluxo de íons) gera calor (chamado aquecimento Joule) numa taxa de I2R joules por segundo, onde I é a corrente (A) e R a resistência da solução (ohms). Em condições normais, o canal central do capilar é 0,02 a 0,3 K mais quente do que a borda do canal. A viscosidade da solução é menor na região mais quente, que perturba o perfil eletroosmótico uniforme do fluido. Isto não é um problema sério em um tubo capilar com 50 mm de diâmetro, mas o gradiente de temperatura deveria ser proibido em tubos com diâmetros de > 1 mm. O capilar deve ser suficientemente fino pra dissipar o calor rapidamente. Os gradientes de temperatura perturbam o fluxo e reduzem a resolução. O resfriamento do fluido em alguns instrumentos reduz a condutividade no interior do capilar e ajuda a evitar um aquecimento Joule descontrolado.


5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BRACHT, Adelar; ISHII-IWAMOTO, Emy Luiza. Métodos de Laboratório em Bioquímica. Barueri, SP: Manole, 2003. 439 p.

HARRIS, Daniel C. Análise Química Quantitativa. 5.ed. Rio de Janeiro. LTC - Livros Técnicos e Científicos, 2001. 862 p.

BARRETO Jr., Amaro Gomes; VEIGA Jr., Valdir Florêncio; MACIEL, Maria Aparecida. Cromatografia de troca iônica aplicada no isolamento da fração ácida do óleo de copaíba (Copaifera multijuga) e da sacaca (Cróton cajucara). Disponível em: <http://www.scielo.br>. Acesso em: 17 outubro 2005.

Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro. Soluções - métodos biofísicos de estudo. Disponível em: <http://www.fmtm.br/instpub/fmtm/bioquimica/solucoes.htm>. Acesso em: 17 outubro 2005.

Comentários


Páginas relacionadas