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Determinação do Ponto Isoelétrico da Caseína

Autor:
Instituição: UNOESC
Tema: Determinação do PI da Caseína

Determinação do Ponto Isoelétrico da Caseína


1. INTRODUÇÃO

As sementes de muitas plantas armazenam proteínas nutrientes necessárias para a germinação e o crescimento do broto. A caseína, principal proteína do leite, é um exemplo de proteína nutriente.

A caseína é uma proteína do tipo fosfoproteína encontrada no leite fresco. Representa cerca de 77 a 82% do total de proteínas do leite. Quando coagulada com renina é chamada de "paracaseína" (caseína de coalho) e, quando coagulada através da redução de pH (utilização de ácidos) é chamada "caseína ácida". A terminologia britânica usa o termo "caseinogênio" quando a proteína não está coagulada e "caseína" quando a proteína está coagulada. Como existe no leite é um sal de cálcio.

A caseína não coagula com o calor. É precipitada pelos ácidos ou pela renina, uma enzima proteolítica produzida no estômago dos vitelos (bezerros) recém-nascidos (também é produzida por alguns tipos de plantas e micróbios). A enzima tripsina hidrolisa a peptona retirando o fosfato.

A caseína contém um número razoavelmente alto de peptídios de prolina que não interagem. Não apresenta nenhuma ponte dissulfeto. Como consequência apresenta relativamente pouca estrutura secundária ou estrutura terciária, não formando estruturas globulares. Por isso não pode desnaturar. É relativamente hidrofóbica, tornando-se pouco solúvel em água. Encontra-se no leite como uma suspensão de partículas de caseína (micelas de caseína), de modo que a região hidrófoba (apolar) fica no interior e a região hidrófila (polar) na superfície exposto a água. As caseínas das micelas se prendem juntas por íons de cálcio e interações hidrofóbicas.

Além de ser consumido no leite, produção de derivados do leite (como queijo), a caseína é usada na produção de adesivos, plásticos (para punhos de facas, cabos de guarda-chuvas, botões, etc), como aditivo de alimentos e para a produção de vários produtos alimentícios e farmacêuticos.

O ponto isoelétrico da caseina é 4.6. É o valor de pH onde as cargas elétricas dos aminoácidos se igualam e se anulam e então ela precipita (coagulação ácida). A proteína purificada é insolúvel em água. Enquanto é insolúvel em soluções salinas neutras, prontamente se dispersa em meio alcalino diluído e em soluções salinas tais como oxalato de sódio e acetato de sódio.

A medição da concentração de íons hidrogênio (pH) envolve o uso de eletrodo de vidro, combinado com um eletrodo de referência, conectado a um aparelho normalmente chamado de medidor de pH (pHmetro).

Algumas pessoas com autismo e síndrome de Asperge são sensíveis a caseína e ao gluten.

No caso de amostras com várias proteínas, utiliza-se a técnica de focalização isoelétrica, que constitui na separação das proteínas de acordo com seus pontos isoelétricos. A mistura de proteínas é submetida a um campo elétrico em um meio especificamente projetado para ter um gradiente de pH. As moléculas carregadas positivamente movem-se em direção ao pólo negativo e as carregadas negativamente movem-se em direção ao pólo positivo. Cada proteína migra até alcançar o ponto onde o pH é o mesmo do seu pH isoelétrico. Nesse ponto a proteína possui carga igual a zero e não se move mais, assim cada proteína presente na mistura é focalizada em uma pequena região em seu pH isoelétrico.


2. OBJETIVOS

2.1 Geral

Determinar o ponto isoelétrico da caseína.

2.2 Específicos


3. MATERIAIS E REAGENTES


4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

- Preparar nove tubos de ensaio.

- Fazer as seguintes adições:

Tubo

H2O destilada

Ácido acético 0,01 N (mL)

Ácido acético 0,1 N (mL)

Ácido acético 1,0 N (mL)

1

8,4

0,6

-----

-----

2

7,8

1,2

-----

-----

3

8,8

-----

0,2

-----

4

8,5

-----

0,5

-----

5

8,0

-----

1,0

-----

6

7,0

-----

2,0

-----

7

5,0

-----

4,0

-----

8

1,0

-----

8,0

-----

9

7,4

-----

-----

1,6

- Agitar os tubos de ensaio.

- Medir o pH de cada tubo no pHmetro.

- Adicionar 1mL de caseína em cada tubo.

- Agitar.

- Observar a turvação imediata (tzero).

- Sem agitar, observar a turvação após 20 min.

- Anotar as intensidades das turvações com símbolos, legendar.


5. RESULTADOS

Medindo o pH de cada solução com o auxílio do pHmetro foram obtidos os seguintes valores:

Tubo

pH teórico

pH medido

1

3,99

3,98

2

3,83

3,79

3

3,65

3,75

4

3,5

3,59

5

3,35

3,42

6

3,2

3,24

7

3,05

3,09

8

2,9

3,0

9

2,75

2,83

Quando adicionada a caseína às soluções, observou-se a turvação imediata (tzero) e a turvação e formação de precipitado após 20 min. Os resultados são apresentados na tabela a seguir:

Tubo

Turvação imediata (tzero)

Turvação após 20 min

1

-

-

2

-

-

3

+/-

+/-

4

+

+

5

+

+

6

+

+

7

+

+

8

+/-

-

9

-

-


6. DISCUSSÕES

- A caseína, principal proteína do leite, como todas as proteínas, é formada por aminoácidos unidos por ligações peptídicas. Os radicais, dos aminoácidos, carregados eletricamente são os responsáveis pela carga liquida total das proteínas além de conferirem a estas a capadidade de interação com a água, por hidratação (solvatação).

- Proteínas carregadas eletricamente são solubilizadas pela água, (interagem com a água devido a presença das cargas elétricas), sendo que os aminoácidos carregados positivamente são solvados pelo oxigênio ( d-) e os aminoácidos carregados negativamente são solvatados pelo hidrogênio ( d+). Proteínas não-carregadas eletricamente não são solubilizadas pela água, tornam-se insolúveis e precipitam, formando o corpo de fundo, que é o que ocorre no ponto isoelétrico da caseína, onde removem-se as cargas da mesma.

- Aminoácidos cujo grupo ‘R’ é polar (hidrofílico) e carregado positivamente apresentam dois grupamentos amina e um grupamento carboxila; aminoácidos cujo grupo ‘R’ é polar (hidrofílico) e carregado negativamente apresentam um grupamento amina e dois grupamentos carboxila.

- A caseína tende a ter uma carga elétrica líquida negativa em qualquer pH acima do seu pI (desprotonação). Em qualquer pH abaixo do seu pI, a caseína tende a ter uma carga elétrica líquida positiva. Quanto mais afastado o valor de pH de uma solução de caseína do seu pI, maior será a carga elétrica líquida da mesma.

- O pHmetro é um aparelho medidor de pH que compara o valor emitido por um eletrodo de vidro seletivamente sensível a concentração de H+, com um sinal gerado por uma solução padrão. O aparelho nos fornece valores precisos com até duas casas após a vírgula.

- As variações observadas entre o pH teórico e o pH medido devem-se, provavelmente, a eventuais erros de pipetagem, mínimas variações da normalidade ou até variações no pHmetro.

- O valor do pH onde as cargas elétricas se igualam e se anulam (carga zero) é denominado ponto isoelétrico (pI) ou pH isoelétrico. O pH é, portanto, um grande influenciador da solubilidade das proteínas, podendo assim prever o seu comportamento anfótero; a solubilidade é mínima no ponto isoelétrico e se eleva com o aumento da basicidade ou acidez.

- Observando o comportamento da caseína nas diferentes soluções, notou-se que o seu ponto isoelétrico corresponde ao pH das soluções dos tubos 5, 6 e 7, cujo pH varia entre 3,09 e 3,42.

- Verificou-se que a turvação observada nas soluções no tempo zero é menos intensa do que aquela observada após 20 minutos, pois esse é o tempo necessário para ocorrer a decantação do precipitado.


7. CONCLUSÃO

A caseína, a principal proteína do leite, é uma proteína de reserva ou nutriente. Quando carregada eletricamente, a caseína é solubilizada pela água, sendo que os aminoácidos carregados positivamente são solvatados pelo oxigênio e os carregados negativamente são solvatados pelos hidrogênios da molécula de água. Em determinado valor de pH, que denominamos ponto isoelétrico, as cargas elétricas da proteína se igualam e se anulam (carga zero), a proteína não é mais solubilizada pela água (não interage com a mesma), torna-se insolúvel e precipita. A caseína precipita em pH em torno de 3,09 e 3,42.


8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

BRACHT, Adelar; ISHII-IWAMOTO, Emy Luiza. Métodos de Laboratório em Bioquímica. Barueri, SP: Manole, 2003. 439 p.

LEHNINGER, Albert L.; NELSON, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica. 3. ed. São Paulo: Sarvier, 2002.

Wikipédia. Caseína. Disponível em: <http://pt.wikipedia.org/wiki/Case%C3%ADna>. Acesso em: 29 outubro 2005.

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