Propriedades Gerais dos Lipídios e Determinação do Colesterol

Autor:
Instituição: UNOESC
Tema: Propriedades Gerais dos Lipídios e Determinação do Colesterol

Concentração de Colesterol no Sangue e Propriedades Gerais dos Lipídios


1. INTRODUÇÃO

A definição de lipídios, diferentemente das definições de outros tipos de biomoléculas, não está baseada na estrutura comum, mas em sua solubilidade na água e em solventes não-polares.

Embora não apresentem nenhuma característica estrutural comum todas elas possuem muito mais ligações carbono-hidrogênio do que as outras biomoléculas, e a grande maioria possui poucos heteroátomos. Isto faz com que estas moléculas sejam pobres em dipolos localizados (carbono e hidrogênio possuem eletronegatividade semelhante), razão pela qual estas moléculas são fracamente solúveis em água ou etanol (solventes polares) e altamente solúveis em solventes orgânicos (geralmente apolares). A solubilidade em água varia de acordo com o tamanho da cadeia carbônica e o número de insaturações. Quanto maior a cadeia carbônica e menor o número de insaturações, menor a solubilidade em água.

Os triacilgliceróis (óleos e gorduras) são compostos de três ácidos graxos, cada um em uma ligação éster com uma hidroxila de uma molécula de glicerol. Como as hidroxilas polares do glicerol e os carboxilatos polares dos ácidos graxos estão unidos em ligações do tipo éster, os triacilgliceróis são moléculas hidrofóbicas, essencialmente insolúveis em água. Isso explica porque misturas de óleo e água apresentam duas fases.

A hidrólise de triacilgliceróis catalisada por ácidos resulta na liberação do glicerol e dos ácidos graxos.

Os óleos e gorduras são saponificáveis, ou seja, são hidrolisados por hidróxidos com o aquecimento, num processo chamado saponificação, que resulta na liberação de glicerol e na formação do sal do ácido graxo (sabão).

O índice de saponificação é definido como a quantidade de base consumida no processo de saponificação completa dos ácidos graxos existentes em 1g de gordura. O índice de saponificação de um determinado lipídio varia de acordo com sua composição em ácidos graxos.

O colesterol, o mais importante esterol (classe de lipídios) dos tecidos animais, é anfipático, com um grupo polar (grupo hidroxila) e um corpo não polar hidrocarbônico (núcleo esteróide e cadeia lateral hidrocarbonada). Os esteróis são sintetizados a partir de unidades simples de isopreno com cinco átomos de carbono. Em adição aos seus papéis como constituintes de membrana, os esteróis servem como precursores para uma variedade de produtos com atividades biológicas específicas, entre eles, ácidos biliares, hormônios esteróis (testosterona, aldosterona, cortisol), vitamina D...

O colesterol é obtido no organismo através da biossíntese (fígado) e da dieta. O colesterol é insolúvel em água e, consequentemente, insolúvel no sangue, e para ser transportado pelo sangue ele se liga a proteínas e lipídios e forma um complexo chamado lipoproteína.

São elas as Low Density Lipoproteins, ou LDL, que é a classe maléfica ao ser humano, são capazes de transportar o colesterol do fígado até as células de vários outros tecidos; e as High Density Lipoproteins, ou HDL, podem transportar o excesso de colesterol dos tecidos de volta para o fígado, onde é utilizado para a síntese do ácido biliar. As LDL podem ser responsáveis pela formação de depósitos arteriosclerósicos nos vasos sanguíneos e as HDL podem retardar esse processo.

A concentração sanguínea normal para indivíduos com menos de 29 anos é de 200mg/dL.

O colesterol é sintetizado no fígado a partir de Acetil-CoA. Isto se dá em 4 estágios:

  • Síntese de Mevalonato a partir de 3Acetil-CoA. Nesta fase está concentrada a regulação do processo pelos hormônios insulina (ativadora) e Glucagon (inibidor).
  • Formação do Isopreno ativado (fosforilado) - ocorre com a saída de 1CO2 (o isopreno tem, portanto 5 carbonos) e o gasto de 3 ATPs. Este é um intermediário chave, pois é precursor de muitos outros lipídios naturais.
  • Condensação de 6 unidades, formando o Escaleno (30 carbonos portanto) - já possui a constituição do colesterol porém é de estrutura linear. Também este intermediário pode ser desviado, pois é precursor de vários outros esteróides, inclusive com perda de carbonos.
  • Formação do núcleo esteróide (anéis esteróides específicos) - 4 anéis fundidos são formados, fornecendo a configuração final do colesterol.


2. OBJETIVOS

2.1 Determinação do Colesterol

2.1.1 Geral

Determinar a concentração de colesterol em uma amostra de sangue.

2.1.2 Específicos

  • Determinar a absorbância da amostra soro (sangue) e do padrão de colesterol com o auxílio do espectrofotômetro;
  • Calcular a concentração do colesterol da amostra e comparar com o colesterol padrão.

2.2 Propriedades Gerais dos Lipídios

2.2.1 Geral

Conhecer através de experimentos as propriedades gerais dos lipídios.

2.2.2 Específicos

  • Observar a reação de hidrólise do triacilglicerol pelo KOH;
  • Observar a formação de sabão insolúvel pela adição de CaCl2;
  • Separar os ácidos graxos através do uso de HCl concentrado;
  • Determinar o índice de saponificação;


3. MATERIAIS E REAGENTES

3.1 Determinação do Colesterol

Materiais

Reagentes

Tubos de ensaio

Sangue

Estante para tubos

Padrão de colesterol (200mg/dL)

Banho de aquecimento

Reativo cromogênico

Espectrofotômetro

 

Cubetas

 

Agulha e seringa

 

Garrote

 

Pipeta

 

Pêra

 

Centrifuga

 

Tubos de centrifuga

 

3.2 Propriedades Gerais dos Lipídios

Materiais

Reagentes

Espátula de metal

Manteiga

Tubos de ensaio

KOH 5,6%

Pipeta

H2O destilada

Pêra

CaCl2

Estante para tubos

HCl concentrado

Aparelho para banho de aquecimento

Óleo

Béquer

HCl 0,5M

Pinça de madeira

Fenolftaleína

Bureta

 

Balão de destilação

 

Aparelho de destilação (refluxo)

 

Garra metálica

 

Suporte universal

 



4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.1 Determinação do Colesterol

- Coletar sangue de um voluntário.

- Centrifugar o sangue.

- Transferir 0,1mL da amostra soro (sangue) para um tubo de ensaio (tubo A). OBS: Para retirar somente a parte liquida do sobrenadante, a fibrina (constituinte do soro) deve ser empurrada para baixo com o auxílio do protetor da agulha.

- Transferir 0,1mL de padrão de colesterol para um segundo tubo de ensaio (tubo P).

- Adicionar, a cada tubo, 0,5mL de reativo cromogênico. Agitar.

- Colocar os dois tubos em banho de aquecimento a 37ºC ao abrigo da luz durante 15 min. Resfriar.

- Transferir o conteúdo dos tubos, cada qual para uma cubeta.

- Efetuar leitura da absorbância a 625nm. Utilizar como branco o reativo cromogênico.

4.2 Propriedades Gerais dos Lipídios

A.1 – Saponificação: Colocar uma pequena amostra de manteiga em um tubo de ensaio. Adicionar 5mL de solução alcoólica de KOH 5,6%. Aquecer em banho a 80ºC durante 15 min. Após o período, adicionar 3 gotas da mistura acima a 3mL de água contidos em um outro tubo de ensaio. Agitar. Verificar se houve saponificação.

A.2 – Formação de sabão insolúvel: Transferir cerca de 1mL da solução de saponificação anterior para um tubo de ensaio e adicionar algumas gotas de CaCl2 a 10%. Observar e comentar as observações.

A.3 – Separação de ácidos graxos: Adicionar ao tubo em que se processou a saponificação (item A1), HCl concentrado, gota a gota, com agitação, até alteração permanente para vermelho. Mergulhar o tubo em água gelada, sem agitar. Observar e comentar.

B – Índice de saponificação: Pesar 1g de óleo e colocar em um balão de destilação. Adicionar 10mL de KOH a 5,6% e colocar em refluxo, em banho de água fervente por 30 min. A solução deverá estar límpida após este intervalo, se não estiver, continue o refluxo.

Ao mesmo tempo, fazer um branco, nas mesmas condições, porém com 10mL de solução de KOH a 5,6% sem amostra.

Resfriar os 2 frascos, e titular com HCl 0,5M, usando fenolftaleína como indicador.

Calcular o índice de saponificação da amostra, de acordo com os seguintes cálculos:

Volume de HCl 0,5M gasto para titular o branco (x)

Volume de HCl 0,5M gasto para titular a amostra (y)

V = x – y Esta diferença corresponde à quantidade de KOH consumido na saponificação (não titulado), ou seja, saponificação completa do lipídio.

Índice de saponificação (IS) = mg de KOH/g de gordura.


5. RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 Determinação do Colesterol

Após a coleta e centrifugação do sangue, observou-se que as hemáceas (parte mais densa) ficaram no fundo do tubo (vermelho); e a parte menos densa, contendo o colesterol formou o sobrenadante. A fibrina (substância gelatinosa) foi empurrada para baixo para retirarmos a amostra somente da parte líquida do sobrenadante, conforme o esquema a seguir:

Ao adicionarmos o padrão de colesterol com o reativo cromogênico observou-se uma coloração verde clara. Quando o mesmo reativo foi adicionado à amostra soro (sangue) observou-se uma coloração verde mais intenso.

Amostra   Padrão

     

A coloração verde da reação do reativo cromogênico com o colesterol é explicada pela desidratação que ocorre no nível insaturado do núcleo do colesterol. Forma-se um derivado sulfônico que confere a cor verde cuja intensidade é diretamente proporcional à concentração de colesterol existente.

Com o aquecimento, não houve alteração de cor, tanto por parte da amostra quanto do padrão.

Ao efetuarmos a leitura no espectrofotômetro, obtivemos os seguintes resultados:

Absorbância do Padrão: 0,149

Absorbância da Amostra: 0,227

A partir desses valores, calculamos a concentração de colesterol sangüíneo total do voluntário:

[ ]          A

200 mg/dL --- 0,149

   x --- 0,227

x = 304,7 mg/dL

A concentração de colesterol sangüíneo do voluntário correspondente a 304,7 mg/dL, segundo a literatura, é considerada acima do normal (200mg/dL), porém levando em conta os métodos utilizados e as condições do laboratório, o resultado obtido não é confiável.

5.2 Propriedades Gerais dos Lipídios

5.2.1 Saponificação

Ao misturarmos uma pequena amostra de manteiga com KOH 5,6% obteve-se uma solução heterogênea de coloração laranja (cor característica do KOH). A manteiga manteve-se insolúvel. Com o aquecimento obteve-se a homogeneização da solução (adquiriu coloração caramelo).

Adicionamos 3 gotas da solução recém preparada em um tubo de ensaio contendo 3mL de água. Ao agitarmos o tubo, observou-se a formação de espumas.

Os triacilgliceróis (óleos e gorduras) são saponificáveis, ou seja, são hidrolisados pelo hidróxido de potássio, num processo chamado saponificação, que resulta na liberação de glicerol e na formação do sal do ácido graxo (sabão). A utilidade dos sabões está em sua capacidade de solubilizar substâncias insolúveis em água pela formação de agregados microscópicos (micelas). O sabão é anfipático, apresenta uma parte polar, que se liga com a água, e uma parte apolar que se liga com a gordura.

5.2.2 Formação de sabão insolúvel

Ao adicionarmos algumas gotas de CaCl2 10% ao um tubo de ensaio contendo 1mL da solução de saponificação, preparada anteriormente, observou-se a formação se uma substância pastosa (precipitado) de coloração amarela. Sais de cálcio, devido aos seus íons Ca2+ (cátion divalente), reagem com o sabão formando carboxilatos de cálcio insolúveis. A chamada "água dura" é rica em íons Ca2+ e Mg2+.

5.2.3 Separação de ácidos graxos

Ao adicionarmos HCl concentrado, gota a gota (aproximadamente 15 gotas), ao tubo em que se processou a saponificação, com agitação, observou-se a formação de uma solução heterogênea (3 fases): precipitado branco no fundo do tubo, líquido amarelo (fase do meio) e um precipitado alaranjado na superfície.

A hidrólise de triglicerídeos catalisada por ácido resulta na liberação do glicerol e dos ácidos graxos. A adição de HCl a solução de saponificação provocou a precipitação do ácido graxo (precipitado alaranjado da superfície), que é pouco solúvel em água e, em solução aquosa, tende a formar dímeros através de fortes ligações hidrogênio.

5.2.4 Índice de Saponificação

Ao adicionarmos o KOH ao balão de destilação contendo óleo, observou-se a formação de uma solução heterogênea (2 fases) de coloração laranja. O óleo não se mistura com o KOH, e por ser menos denso permanece na superfície.

Com o refluxo, a solução de óleo + KOH 5,6%; e o branco (KOH 5,6% sem amostra) adquiriram coloração caramelo. Após resfriados os 2 frascos, adicionamos 1 gota de fenolftaleína em cada frasco, sendo que a solução de óleo + KOH adquiriu coloração vermelha e o branco adquiriu uma coloração vermelha mais intensa. Por fim, titulamos os frascos com HCl 0,5M.

Para realizar a técnica de titulação, preenchemos a bureta de 50mL com HCl 0,5M. Adicionamos HCl 0,5M às soluções até estas adquirirem uma coloração amarelo clara. O volume consumido pelo branco foi de 15,5 mL, enquanto o volume consumido pela amostra foi de 8mL. O volume consumido pelo branco é maior do que o da amostra devido à presença de uma quantidade maior de base livre. Na amostra, uma parte do KOH é consumido pelo óleo para formar o sabão.

Da saponificação de um éster com uma quantidade conhecida de base, pode-se obter o índice de saponificação, que é o número de mg de KOH necessário para saponificar completamente um g de gordura. O índice de saponificação de um determinado lipídio varia de acordo com sua composição em ácidos graxos.

6. CONCLUSÃO

Com o experimento da Determinação do Colesterol concluiu-se que o voluntário apresenta concentração de colesterol sanguíneo correspondente a 304,7 mg/dL, o que, comparado com a literatura, é considerado acima do normal (200mg/dL).

A determinação do colesterol é baseada nas diferentes intensidades de coloração adquiridas pela amostra e pelo padrão com a adição do reativo cromogênico e pela comparação destes, sendo que a intensidade das colorações é diretamente proporcional à concentração de colesterol existente. A concentração de colesterol sangüíneo do voluntário foi calculada a partir dos valores de absorbância obtidos pelo padrão e pela amostra com uma regra de três simples.

Com os experimentos que envolveram as propriedades gerais dos lipídios pode-se concluir que os triacilgliceróis sofrem um tipo de reação, denominada saponificação, com hidróxidos quando aquecidos para formar o sabão. Em contato com a água, a solução resultante dessa reação, provoca a formação de espumas. A parte polar do sabão é solúvel em água e a parte apolar é solúvel em lipídios.

A reação do sabão com o cloreto de cálcio resulta na formação de um composto insolúvel (precipitado). A reação de HCl concentrado com a solução de saponificação resulta na precipitação dos ácidos graxos.

O índice de saponificação pode ser calculado através da técnica de titulação e dos dados obtidos através desta técnica.


7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

LEHNINGER, Albert L.; NELSON, David L.; COX, Michael M. Princípios de bioquímica. 3. ed. São Paulo: Sarvier, 2002.

VIEIRA, Enio Cardillo; GAZZINELLI, Giovanni; MARES-GUIA, Marcos. Bioquímica Celular e Biologia Molecular. 2.ed. São Paulo: Atheneu, 2002.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA – UFSC. Lipídios: as biomoléculas hidrofóbicas. Disponível em: <http://qmc.ufsc.br/qmcweb/artigos/lipidios/lipidios.html>. Acesso em: 27 novembro 2005.

WIKIPEDIA. Colesterol. Disponível em: <http://pt.wikipedia.org/wiki/Colesterol>. Acesso em: 27 novembro 2005.

UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA – UNB. Biossíntese de colesterol. Disponível em: <http://www.lbqp.unb.br/bioq/htm/textos_explic/sint_de_colest.htm>. Acesso em: 27 novembro 2005.

Sabões e detergentes. Disponível em: <http://www.members.tripod.com/alkimia/curiosidades/saboes.htm>. Acesso em: 27 novembro 2005.

Comentários